|
|
Mutantní glykosidasy s vysokou substrátovou specifitou a jejich analýza
Nekvasilová, Pavlína ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
β-N-Acetylhexosaminidasy (EC 3.2.1.52, GH20) jsou retenující exo-glykosidasy, které in vivo odštěpují jak β-N-acetylglukosamin (GlcNAc), tak β-N-acetylgalaktosamin (GalNAc) z glykosylovaných struktur. Za vhodných reakčních podmínek jsou tyto enzymy schopné glykosidovou vazbu i syntetizovat. Cílenou mutagenezí v aktivním centru enzymu lze např. dosáhnout změny substrátové specifity nebo potlačit hydrolytickou aktivitu enzymu ve prospěch syntézy. Předkládaná práce se zabývá třemi mutantními β-N-acetylhexosaminidasami z Talaromyces flavus. V jejich aktivním centru byla provedena záměna aminokyselinových zbytků, které jsou zodpovědné za vazbu hydroxylu na C-4 substrátu (Arg218, Glu546), za aminokyseliny navržené na základě molekulárního modelování. Byl studován vliv vnesených jednobodových mutací na substrátovou specifitu připravených enzymů. Mutantní β-N-acetylhexosaminidasy byly heterologně exprimovány v Pichia pastoris a charakterizovány. Dále byly provedeny transglykosylační reakce s těmito enzymy. Připravené sacharidové produkty byly charakterizovány pomocí NMR.
|
|
| |
|
| |
|
|
Mutantní glykosidasy s vysokou substrátovou specifitou a jejich analýza
Nekvasilová, Pavlína ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
β-N-Acetylhexosaminidasy (EC 3.2.1.52, GH20) jsou retenující exo-glykosidasy, které in vivo odštěpují jak β-N-acetylglukosamin (GlcNAc), tak β-N-acetylgalaktosamin (GalNAc) z glykosylovaných struktur. Za vhodných reakčních podmínek jsou tyto enzymy schopné glykosidovou vazbu i syntetizovat. Cílenou mutagenezí v aktivním centru enzymu lze např. dosáhnout změny substrátové specifity nebo potlačit hydrolytickou aktivitu enzymu ve prospěch syntézy. Předkládaná práce se zabývá třemi mutantními β-N-acetylhexosaminidasami z Talaromyces flavus. V jejich aktivním centru byla provedena záměna aminokyselinových zbytků, které jsou zodpovědné za vazbu hydroxylu na C-4 substrátu (Arg218, Glu546), za aminokyseliny navržené na základě molekulárního modelování. Byl studován vliv vnesených jednobodových mutací na substrátovou specifitu připravených enzymů. Mutantní β-N-acetylhexosaminidasy byly heterologně exprimovány v Pichia pastoris a charakterizovány. Dále byly provedeny transglykosylační reakce s těmito enzymy. Připravené sacharidové produkty byly charakterizovány pomocí NMR.
|
|
|
Enzymatické modifikace GlcNAc-thiazolinových inhibitorů hexosaminidas
Šmeringaiová, Ingrida ; Weignerová, Lenka (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Tato práce se zabývá problematikou hledání účinných inhibitorů enzymů β-N- acetylhexosaminidas, které jsou odvozeny od 1,2-dideoxy-2'-methyl-α-D-glukopyranoso-[2,1- d]-Δ2'-thiazolinu (NGT). Práce je orientována na produkci inhibitorů odvozených od struktury NGT, acetylací jeho molekuly pomocí volných a na nosičích imobilizovaných lipas. Potenciální inhibitory β-N-acetylhexosaminidas mohou být účinnými nástroji pro studium těchto enzymů v buněčných procesech a taktéž otevírají dveře k nalezení možných terapeutik pro léčbu některých neurodegenerativních chorob, jako např. Alzheimerova nemoc. V práci je věnována pozornost stručné charakterizaci β-N-acetylhexosaminidas, a to hlavně glykosidas ze skupin označovaných GH 20 a GH 84. V experimentech byly konkrétně využity β-N-acetylhexosaminidasy člověka1 a z mikroorganismů Bacteroides thetaiotao-micron, Aspergillus oryzae, Streptomyces plicatus, Talaromyces flavus. Enzymy byly produkované, izolované, purifikované a následně byla otestována jejich aktivita. 6-O-Acetyl-1,2-dideoxy- 2'-methyl-β-D-glukopyranoso-[2,1-d]-Δ2'-thiazolin byl testován jako inhibitor zkoumaných enzymů. Výchozí látka NGT byl připraven modifikovaným postupem podle Knappa2 z 2- acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-α-D-glukopyra-nosy reakcí s Lawessonovým činidlem. Předmětem další...
|
|
|
Studium β-N-acetylhexosaminidasy v rostlinách tabáku
Valenta, Robert ; Tichá, Marie (oponent) ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce)
β-N-acetylhexosaminidasy jsou přítomny ve všech živých organismech, avšak informací o tomto enzymu v rostlinách a především listech je známo málo. V případě rostlinných β-N-acetylhexosaminidas se spekuluje o možné obranné funkci proti houbovým i jiným patogenům a také o degradaci zásobních glykoproteinů. Z listů tabáku (Nicotiana tabacum L.) byla precipitací síranem amonným, gelovou chromatografií na koloně Sephacrylu S-300 a afinitní chromatografií na koloně Con A-Sepharosy připravena β-N- acetylhexosaminidasa o specifické aktivitě 190 nmol min-1 mg-1 pro substrát p-NP-GlcNAc. Byla stanovena Michaelisova konstanta a maximální rychlost reakce β-N- acetylhexosaminidasy pro substrát p-NP-GlcNAc (Km = 0,33 mM a Vmax = 414 nmol min-1 mg-1 ). Pomocí kapilární elektroforézy bylo studováno štěpení diacetylchitobiosy β-N- acetylhexosaminidasou. Stanovená aktivita β-N-acetylhexosaminidasy pro diacetylchitobiosu byla více než jedenáctkrát nižší než v případě aktivity β-N-acetylhexosaminidasy pro substrát p-NP-GlcNAc. Z těchto výsledků lze usoudit, že chitobiosa, a pravděpodobně ani další chitooligomery, nejsou přirozeným substrátem β-N-acetylhexosaminidasy a tedy neslouží primárně k ochraně před houbovými patogeny. Přirozeným substrátem by mohly být spíše oligosacharidové řetězce glykoproteinů.
|
host ::
RSS.